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Premessa

L’attenzione di numerosi ricercatori è sempre più orientata alla ricerca delle cause, dei fisiologismi e delle conseguenze dello stress ossidativo. Comprendere i fisiologismi del danno ossidativo significa modificare radicalmente sia le modalità di approccio diagnostico che quelle terapeutiche. In questa disamina viene evidenziata la natura dello stress ossidativo e le sue varie tipologie, focalizzando l’attenzione sulla serie limitata del DNA mitocondriale e sul fatto che i danni individuati in questa serie sono numericamente superiori a quelli individuati nel DNA nucleare. L’espressività genica viene fortemente condizionata da moltissimi fattori stressogeni e, tra questi, i componenti vaccinali. Quali effetti sul metabolismo cellulare? Quali conseguenze sul metabolismo dei tessuti, degli organi, dei sistemi? Quali implicazioni con il numero sempre crescente di patologie autoimmuni? A voi il percorso di conoscenza. (Premessa a cura di Davide Suraci, alias autoimmunityreactions, alias yellowbrain)

Tipi di danni ossidativi a mitocondri e mtDNA

^[1]È possibile che si verifichino diversi tipi di danni ossidativi, di cui solo una ^[1a]serie limitata è stata specificamente individuata nel DNA mitocondriale, mentre si sospetta che la ^[1b]maggior parte di questo tipo di danni si verifichi nei mitocondri a causa delle condizioni ossidative della matrice. ^[1c]È noto da oltre un decennio che il livello stazionario del danno ossidativo nell‘mtDNA è superiore a quello dell‘nDNA: ^[1b]il DNA mitocondriale subisce 3-10 volte più danni del DNA nucleare a seguito di stress ossidativo. I danni endogeni ed ambientali influiscono quindi sul metabolismo del DNA mitocondriale che, avendo delle limitatissime capacità di autoriparazione, è maggiormente soggetto a mutazioni.

Nel medesimo periodo di tempo, i ricercatori hanno identificato e misurato varie forme di ^[2]danno endogeno ed ambientale del DNA mitocondriale o mtDNA –ossia il DNA collocato all’interno dei mitocondri con 16.569 paia di basi e 37 geni che codificano 13 polipeptidi, 22 tRNA e 2rRNA, che è coinvolto nella produzione di proteine necessarie alla respirazione cellulare– esplicando i suoi percorsi di riparazione. È interessante notare che i mitocondri ^[2a]sembrano contenere solo una parte dei molteplici meccanismi di riparazione dell‘nDNA, o DNA nucleare, anche se il loro tipo di danno ^[2b]caratterizza anche il DNA mitocondriale, la cui ridotta capacità di riparazione può quindi, in parte, spiegare l’alta frequenza di mutazioni del cromosoma mitocondriale

^[1b]Negli ultimi 15 anni è stato effettivamente evinto che nei mitocondri mancano gli enzimi necessari per la riparazione dell’escissione nucleotidica, la via principale per l‘eliminazione degli addotti al DNA –in genetica molecolare, un addotto al DNA è un frammento del DNA covalentemente legato ad una sostanza chimica, che potrebbe rappresentare l‘inizio della formazione di cellule cancerose– risultanti dall’esposizione ai raggi UV, dall‘esposizione/ingestione a/di idrocarburi policiclici aromatici cancerogeni ed agenti chemioterapici

^[2c]A differenza del DNA nucleare, caratterizzato da meccanismi multipli per la propria riparazione, i mitocondri appaiono dunque limitati nella loro capacità di correggere tutte le possibili forme di danno sia proprie che al DNA mitocondriale

^[3]Poiché la replicazione dell’mtDNA dipende dalla trascrizione genica, un suo eventuale danno può alterare l’espressione genica mitocondriale nei seguenti modi:

• causa ^[3a]errori di incorporazione del neuclotide del DNA-polimerasi di tipo γ che portano a mutazioni

Le mutazioni possono essere spontanee, ereditarie da parte di madre, oppure il risultato appunto di difetti del DNA nucleare presenti in quei geni che mantengono il DNA mitocondriale

• ^[3b]interferisce con il priming della replicazione dell‘mtDNA per quel che concerne RNA-polimerasi;

La replicazione del DNA mitocondriale e la correlata trascrizione sono strettamente correlate, in quanto il sistema per la trascrizione mitocondriale fornisce le trascrizioni per i primer RNA per la replicazione di DNA mitocondriale ed espressione genica

• induce ^[3c]mutagenesi trascrizionale oppure terminazione prematura della trascrizione

L‘espressione genica mitocondriale è fondamentale per mantenere l’omeostasi cellulare: il suo controllo è unico in quanto i suoi componenti hanno doppia origine nei mitocondri (tutti gli RNA) e nel nucleo (tutti i fattori proteici). La regolazione della sintesi e della degradazione degli mtRNA, ossia RNA mitocondriali, determina i livelli stazionari delle proteine codificate a livello mitocondriale, permettendo così un accurato controllo del metabolismo energetico mitocondriale, creando quindi quelle basi affinché le cellule possano adattarsi alle variazioni degli stress ambientali e soddisfare le nuove richieste di energia cellulare. I difetti nell’espressione genica mitocondriale possono portare a disfunzioni della catena respiratoria con conseguente fenotipo di malattia multisistemica, che colpisce prevalentemente i tessuti muscolari e neuronali

^[4]La replicazione e la funzione mitocondriale richiedono proteine codificate nel DNA nucleare; pertanto, la loro funzione nel complesso è sotto doppio controllo genetico

Ruolo e funzioni dei mitocondri

I ^[4]mitocondri ospitano il piccolo genoma circolare nelle cellule umane che è essenziale per la vita

Le molteplici funzioni svolte dai mitocondri, in particolare il loro ^[4a]coinvolgimento nella regolazione della risposta immunitaria innata, ne fanno un bersaglio privilegiato per i patogeni batterici in quanto rappresentano una ^[4b]componente chiave del metabolismo centrale attraverso la produzione e la sintesi di adenosina trifosfato (in inglese Adenosine Triphosphate o ATP) e di varie biomolecole

^[4c]Tutte le vie metaboliche della degradazione ossidativa di carboidrati, acidi grassi ed amminoacidi convergono in una tappa finale, in cui l’energia prodotta dalle ossidazioni viene utilizzata per la sintesi di adenosina trifosfato o ATP, che si verifica in seguito al trasferimento degli elettroni, sottratti durante le ossidazioni, all’ossigeno

Oltre ad avere un ruolo cardine nella ^[4a]risposta immunitaria innata, i mitocondri partecipano anche alla ^[4d]segnalazione cellulare attraverso la produzione di specie reattive dell’ossigeno (in inglese reactive oxygen species o ROS) che danneggiano i lipidi di membrana e le proteine, oltre al DNA mitocondriale o mtDNA ed infine il ^[4e]controllo dell’omeostasi del calcio e il controllo della sopravvivenza cellulare / morte cellulare programmata

Caratteristica dei mitocondri è che ^[5]l’ambiente della matrice mitocondriale è piuttosto inospitale per le macromolecole che vi risiedono. Sia la ^[5a]capacità metabolica che la composizione della membrana dei mitocondri rendono la matrice di questi organelli un probabile sito per la generazione di una serie di aldeidi reattive. Le aldeidi, prodotte fisiologicamente nei nostri tessuti, vengono secrete in aumentato numero, ad esempio durante il metabolismo degli alcolici, e possono entrare nell’organismo umano anche dall’ambiente, dove sono presenti con altri agenti reattivi

Durante la normale risposta immunitaria, ^[5b]i mitocondri divengono promotori dell’infiammazione, che svolge un ruolo cardine: ^[5c]l’infiammazione è il tentativo dell’organismo di proteggersi da situazioni nelle quali, senza essa ed i suoi effetti secondari che svolgono un ruolo di limite, avverrebbero conseguenze più dannose

Il suddetto concetto viene megnificamente esplicitato dal Prof. Dr. George Vithoulkas insieme allo studioso ricercatore Stefano Carlino nella loro pubblicazione scientifica dal titolo ^[5c]«The “continuum” of a unified theory of disease», che porta in evidenza come l’organismo umano invii tutta una serie di segnali (i c.d. sintomi) in modo tale che essi possano essere accompagnati dolcemente, piuttosto che soppressi, rispettando quindi l’organismo nella sua interezza e totalità. Qualora si “sopprima” un sintomo, evitando d’ascoltare il messaggio che esso porta, ecco che nel tempo la serie di segnali aumenta in termini d’intensità e profondità sino a coinvolgere in crescendo gli organi vitali più importanti: in caso anche dopo tale fase questi segnali continuino ad esser ignorati sopprimendone i sintomi, diverranno ulteriormente intensi e prenderanno il sopravvento su tutto l’organismo

^[5d]Lo stress ossidativo –noto come causa di induzione di allergie, patologie autoimmuni o neurodegenerative con alterazione della crescita cellulare ed infezioni croniche– prodotto da un’infiammazione irrisolta e persistente (low grade inflammation) può esser un fattore importante coinvolto nel cambiamento della dinamica delle risposte immunitarie, apportando alterazioni che creano un caos immunologico con conseguente perdita di integrità architettonica delle cellule e dei tessuti, portando a condizioni croniche e/o neoplasia, cancro metastatico ed angiogenesi

Ad ulteriore conferma del suddetto concetto vi è quanto scoperto nello ^[5e]studio scientifico «Stimulated Human Mast Cells Secrete Mitochondrial Components That Have Autocrine and Paracrine Inflammatory Actions»: la somministrazione intraperitoneale di mtDNA isolato da cellule LAD2 nei ratti è stato rilevato nel loro siero entro 4 ore, indicando che mtDNA extravascolare potrebbe entrare nella circolazione sistemica. La secrezione dei componenti mitocondriali da parte dei mastociti vivi stimolati può agire come “autopatogeno” contribuendo alla patogenesi delle malattie infiammatorie

Le molteplici sostanze chimiche presenti nell’ambiente, i metaboliti dei componenti dietetici, i farmaci nelle terapie cliniche e/o in generale le procedure mediche, oltre all’esposizione ai raggi UV –si noti che ^{[Ib, II]}l’irradiazione con la luce solare è un fattore differente ed ha un ruolo importantissimo per la reazione enzimatica e la ^[I]fosforilazione ossidativa, tematica qui di seguito approfondita– sono fonti esterne di danni al DNA mitocondriale

^[IIIa]I succitati elementi amplificano nell’organismo la produzione di lesioni endogene del DNA e generano addotti unici al DNA, oltre a – fra i molteplici possibili effetti consequenziali – inibire la trascrizione mitocondriale. Pertanto, nella valutazione dell’esposizione ambientale o della tossicità di una profilasi farmacologica, si dovrebbe considerare come possibile conseguenza la disfunzione dell’espressione genica mitocondriale o la mutagenesi dell’mtDNA

Danni al DNA nucleare versus DNA mitocondriale

^[6]Mentre il DNA nucleare è racchiuso in nucleosomi, le molecole di mtDNA sono strettamente associate alla matrice mitocondriale e formano strutture compatte quali i nucleoidi

A differenza dei geni nucleari, ognuno dei quali ha spesso più promotori dedicati, ^[6a]tutti i geni mitocondriali sono espressi insieme da tre soli promotori, che sono riconosciuti dal meccanismo di trascrizione basale mitocondriale: la polimerasi dell’RNA mitocondriale, e i fattori di trascrizione mitocondriale Tfam e Tfb2m

I nucleotidi sono composti da complessi proteici che includono proteine coinvolte nella replicazione e nella trascrizione, come i seguenti tre promotori dei geni mitocondriali:

• fattore di trascrizione mitocondriale A, che svolge un ruolo significativo nella replicazione dell’mtDNA, nella trascrizione e nella struttura/organizzazione del nucleoide mitocondriale;

• polimerasi gamma, che è coinvolto nel mantenimento della stabilità genomica mitocondriale;

• proteina legante a singolo filamento mitocondriale (in inglese single-strand binding protein o RPA), che insieme al fattore di trascrizione mitocondriale A ha il compito di sintetizzare una replica esatta del genoma mitocondriale durante il processo di replicazione

Per combattere i danni al DNA nucleare, i mitocondri possiedono percorsi di riparazione che comprendono proteine di riparazione codificate da geni nucleari che vengono trasportate ai mitocondri. È ancora piuttosto poco chiaro se questi enzimi di riparazione preesistano nei mitocondri al momento del danno o vi si trasferiscano in risposta ai segnali di danno

Le vie di riparazione del DNA nucleare sono le seguenti:

• ^[2a]inversione diretta (in inglese direct reversal o DR) tramite il controllo dell’attività del gene glycosylasea uracile DNA (UNG) negli estratti mitocondriali;

• riparazione del disequilibrio (in inglese mismatch repair o MMR) tramite la correzione dei disallineamenti nel DNA della polimerasi -sintetizzato;

• riparazione della rottura del doppio filamento (in inglese double-strand break repair o DSBR) tramite la replicazione dei filamenti di DNA principali e dei filamenti di DNA in fase di sviluppo;

• riparazione dell’escissione di base (in inglese base excision repair o BER), che inizia con riconoscimento ed eliminazione di una base danneggiata oppure inadeguata da parte della glicosilasi del DNA che scinde il legame N-glicosilico fra la base ed il glucosio;

• sintesi della translesione (in inglese translesion synthesis o TLS), comporta il passaggio temporaneo dalle polimerasi δ e ε replicative alle polimerasi a rischio di errore, come la pol η, con siti attivi abbastanza grandi che possono ospitare lesioni del DNA, permettendo così il loro bypass

Un ampio ^[6b]spettro di danni sia al DNA nucleare che al DNA mitocondriale viene arrecato dagli ossidanti liberi sia radicali che non radicali generati all’interno delle cellule

In tale range sono comprese ^[6c]piccole modifiche alle basi, come 8-oxo-2′-deossiguanosina (8-oxo-dG) o 8-oxo-7,8-diidro-2′-deossiguanosina (8-oxodG) –sia nel DNA nucleare che mitocondriale è una delle forme predominanti di lesioni ossidative indotte dai radicali liberi ed è stata quindi ampiamente utilizzata come biomarcatore per lo stress ossidativo e la carcinogenesi– ed ^[6d]insulti alla spina dorsale zucchero-fosfato –importante componente strutturale del DNA nucleare che si compone di 5 zuccheri carboni disossiribososio e gruppi fosfato, estremamente importanti nella funzione del DNA nucleare stesso– come siti abasici, anelli ossidati di desossiribosio e rotture del filamento del DNA, solo per citarne alcuni

^{[1b, 2c]}Fino ad oggi, solo una serie limitata di questi danni caratteristici sia del DNA nucleare che del DNA mitocondriale sono stati specificamente rilevati in quest‘ultimo, ma si sospetta che la maggior parte di essi si verifichi nei mitocondri, a causa delle condizioni ossidative della matrice mitocondriale

I casi di danno dei ^[7]siti abasici, dovuti principalmente alla perdita di purina dal DNA, si verificano ad un livello stazionario di >50.000 siti per cellula nei tessuti dei mammiferi. Il ^[7a]cervello, ricco di mitocondri, ha il maggior numero di siti abasici

Il 2′-deossiriboso del sito abasico può essere ^[7b]ossidato per formare zuccheri modificati e rotture di singoli filamenti. I siti abasici e le rotture del filamento a filo singolo (in inglese single strand breaks o SSBs) sembrano essere le forme predominanti di danno all‘mtDNA prodotto da H₂O₂ –perossido di idrogeno, noto anche come acqua ossigenata, è il più semplice dei perossidi– e dallo stress ossidativo indotto dai rotenoni nelle cellule in coltura

Oltre a danneggiare direttamente il cromosoma mitocondriale, ^[8]gli ossidanti biologici possono reagire con i nucleotidi liberi producendo substrati aberranti per la sintesi del DNA mitocondriale e dell’RNA: mentre i mitocondri possiedono un enzima in grado ad esempio di eliminare 8-oxo-2′-deossiguanosina (8-oxo-dG) dal gruppo di substrati, possono verificarsi e persistere anche altri danni ai nucleotidi

Fosforilazione e fotocatalisi

^[I]La fosforilazione ossidativa –nelle cellule eucariotiche ha luogo nei mitocondri – corrisponde alla sintesi di ATP ed induce la generazione di ^[Ia]una serie di molecole reattive all’interno dei mitocondri, a causa della fuga di elettroni dalla catena di trasporto; ^[Ib]in tale contesto la fotocatalisi –sistema catalitico attualmente poco noto che applica l’irraggiamento solare e reazioni foto-chimiche– implica raggiungere/attivare nei mitocondri i processi di eccitazione degli atomi delle molecole di acqua presenti nei mitocondri stessi, decomponendone alcune molecole in ossigeno e idrogeno, rilasciando quindi elettroni

I processi metabolici nei mitocondri generano ^[3a]lesioni del DNA che è impossibile riparare ed interferiscono con la replicazione e la trascrizione dell’mtDNA per tutti quei tessuti altamente dipendenti dall’ossigeno e quindi dalla fosforilazione ossidativa, anche indirettamente correlati in quanto semplicemente beneficiano degli effetti conseguenti alla fosforilazione stessa, come ^[II]quelli di:

• cervello, in specifico sistema nervoso centrale e periferico;

• muscolo cardiaco, scheletrico e muscolatura liscia in generis;

• pancreas, in specifico cellule β pancreatiche produttrici di insulina;

• reni

Al contempo si evidenzia che ^{[Ib, III]}negli ultimi anni sono stati trovati numerosi enzimi che mostrano uno spettro di reazione completamente diverso o esteso in conseguenza alla fotocatalisi , ossia all’irradiazione con la luce solare, in specifico a tipo, quantità e latitudine di irradiazione solare giornaliera

Ad oggi ^[IV]l’attivazione fotochimica degli enzimi non è ancora diventata un approccio standard: uno dei fattori limitanti è stata la cinetica relativamente scarsa di trasferimento degli elettroni fotoeccitati all’enzima, un altro è rappresentato dalla generazione di forti ossidanti e radicali liberi reattivi

^[8a]Una degradazione dell’mtDNA si verifica per compensare lo squilibrio del gruppo nucleotidico, al fine di ripristinare i rapporti di nucleotidi necessari per una corretta sintesi del DNA mitocondriale stesso

I genomi ed i loro nucleotidi precursori sono altamente esposti a specie reattive dell’ossigeno (in inglese reactive oxygen species o ROS), generati sia come sottoprodotti della respirazione dell‘ossigeno o esecutori molecolari nella difesa dell‘ospite, sia per esposizione ambientale a radiazioni ionizzanti e sostanze chimiche

Il ^[9]superossido, non potendo diffondersi attraverso la membrana mitocondriale interna (in inglese Inner Mitochondrial Membrane o IMM) si limita alla matrice mitocondriale, dove può interagire con le proteine Fe-S per liberar ferro / esser convertito in perossido di idrogeno dalla dismutasi manganese-superossido, Mn-SOD

^[9a] Il perossido di idrogeno, a differenza del superossido, può diffondersi attraverso la membrana mitocondriale interna, eppure rimanendo nella matrice può essere sottoposto alla chimica di Fenton con Fe(II) per produrre radicali idrossili, altamente reattivi nei confronti del DNA e degli acidi grassi polinsaturi (in inglese Polyunsaturated Fatty Acids o PUFAs)

^[9b]L’auto-ossidazione dei legami insaturi negli acidi grassi polinsaturi porta alla formazione di prodotti aldeidi distintivi che vengono regolarmente neutralizzati dalla coniugazione del glutatione o dall’attività dell’aldeide deidrogenasi nei mitocondri

^[10]Le membrane esterna mitocondriale e quella plasmatica cellulare, i DNA nucleare e mitocondriale possono essere esposti ad una diversa miscela di aldeidi α,β-insaturi, ossidanti non radicali –i più diffusi sono 4-HNE, malondialdeide (MDA), acroleina e crotonaldeide– in grado d’indurre alterazioni delle proteine e del DNA mitocondriale nella matrice e di diffondersi verso l’esterno attraverso la membrana mitocondriale interna

Negli ultimi anni sono stati studiati i ^[11]polimorfismi mitocondriali del DNA e le mutazioni somatiche, al fine di comprendere l’ereditarietà delle patologie umane, la longevità e la migrazione delle popolazioni: alcune sequenze del cromosoma del DNA mitocondriale sembrano essere instabili nel corso naturale dell’invecchiamento, così come molte variazioni di singoli nucleotidi nel mtDNA sono benigne, ma alcune favoriscono l’insorgenza di patologie

La ^[11a]neurodegenerazione osservata durante sia l’invecchiamento che alcune patologie può insorgere a causa di insulti multipli che impattano sull’mtDNA, alcuni dei quali possono inibire la sintesi di pol γ per indurre mutagenesi e delezioni di mtDNA

Le cellule ^[11b]possono contenere migliaia di copie del cromosoma mitocondriale, e prima che in una cellula sorgano fenotipi biochimici dev’essere compromesso un determinato livello di soglia dell‘mtDNA: parrebbe quindi esserci un ^[11c]controllo orchestrato delle condizioni della matrice mitocondriale, della dinamica mitocondriale e dei meccanismi di mantenimento dell‘mtDNA che permettono un cambiamento genetico naturale, prevenendo al contempo mutazioni e degradazione patogenetiche dell‘mtDNA

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